人気ゲーム「スーパーマリオブラザーズ」シリーズの世界を描いたアニメの劇場版第2弾。マリオとルイージや、新たな相棒ヨッシーらが、クッパJr.の野望を阻止すべく宇宙への冒険の旅に出る。監督は前作『ザ・スーパーマリオブラザーズ・ムービー』に引き続きアーロン・ホーヴァスとマイケル・ジェレニックが担当。ボイスキャストはクリス・プラット、アニャ・テイラー＝ジョイ、チャーリー・デイ、日本語吹替版は宮野真守、志田有彩、畠中祐らが続投している。

双子の配管工マリオとルイージは、キノコ王国でピーチ姫を支えながら、捕らわれたクッパや王国の人たちのために奔走していた。ある日、二人は新たな相棒ヨッシーに出会う。彼らはピーチ姫の誕生日パーティーをきっかけに、邪悪な野望を抱くクッパJr.と闘うため、ロゼッタを守る宇宙へと旅立つ。